高中生物选修一（生物技术实践）

专题一  传统发酵技术的应用

课题一 果酒和果醋的制作

基础知识

1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。

2、类型：据是否需要氧气分：有氧发酵：如醋酸发酵 谷氨酸发酵·无氧发酵：如酒精发酵 乳酸发酵．据产生的产物分为：醋酸发酵 、谷氨酸发酵、酒精发酵 、乳酸发酵等

（一）果酒制作原理

1、菌种是酵母菌,属于真核生物。新陈代谢类型是异养兼性厌氧型。

    酵母菌的生殖方式：主要是出芽生殖

2、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。反应式为： C₆H₁₂O₆＋6O₂＋6H₂O→6CO₂＋12H₂O+能量

3、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。反应式为：C₆H₁₂O₆→2C₂H₅OH＋2CO₂+能量

4、酵母菌繁殖最适温度20℃左右。酒精发酵时一般将温度控制在18℃-25℃

（1）菌种来源：在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌．在发酵过程中,随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色．在缺氧 呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。

1、果醋制作的原理

1、菌种是醋酸菌．醋酸菌是单细胞原核生物,代谢类型是异养需氧型,生殖方式为二分裂．醋酸菌的最适生长温度为30-35⁰C，需要充足的氧气．

2、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。                 

  C₆H₁₂O₆＋2O₂→2CH₃COOH＋2CO₂＋2H₂O                  C₂H₅OH＋O₂→CH₃COOH＋H₂O

二、控制发酵条件的作用①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最适生长温度为30-35℃，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。③有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。

实验设计

1、实验流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒（→醋酸发酵→果醋）

2、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。先在试管中加入发酵液2ｍL，再滴入物质的量浓度为3mol/L的H₂SO₄  3滴，振荡混匀，

3、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的是防止空气中微生物的污染。开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。

课题二 腐乳的制作

1、菌种：腐乳的发酵有多种微生物的协同作用，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。营腐生生活。

2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。

3、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。

前期发酵的主要作用：1．创造条件让毛霉生长。2．使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。

后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。

4、实验流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制

（1）将豆腐切成3cm×3cm×1cm的若干块。（所用豆腐的含水量为70％左右，水分过多则腐乳不易成形。）将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的温度控制在15～18℃，并保持一定的湿度，让豆腐上长出毛霉。

毛霉的来源：1．来自空气中的毛霉孢子，2． 直接接种优良毛霉菌种

时间：5天

（2）加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为8天左右。用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味

·食盐的作用：1．抑制微生物的生长，避免腐败变质2．析出水分，使豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂3．调味作用，给腐乳以必要的咸味4．浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。

（3）配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右。

·酒的作用：1．防止杂菌污染以防腐2．与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味3．酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。

·香辛料的作用：1．调味作用2．杀菌防腐作用3．参与并促进发酵过程

（4）密封腌制防止杂菌污染：①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。②装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。

课题三 制作泡菜

1、菌种：制作泡菜所用微生物是乳酸菌 ，其代谢类型是异养厌氧型。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素杀死乳酸菌。

2、原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解为乳酸 。分裂方式是二分裂。反应式为：C₆H₁₂O₆ 2C₃H₆O₃+能量   

3、亚硝酸盐性质：亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。

4、膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，国家对亚硝酸盐的规定标准：肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，婴儿奶粉中不超过2mg/kg。亚硝酸盐被吸收后随尿液排出体外，但在适宜pH 、温度和一定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺。

4、一般在腌制 10 天后亚硝酸盐含量开始降低，故在10天之后食用最好

5、测定亚硝酸盐含量的方法是：比色法

原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与 N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，与已知浓度的标准显色液目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。

1、泡菜腌制过程

（1）泡菜坛的选择

a、应选用火候好、无砂眼、无裂纹、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛

b、检查时可将坛口向上压入水中，看坛内有无渗水现象

（2）腌制

A、过程：将清水和盐以4:1的质量比例配制盐水。将盐水煮沸冷却后备用。将蔬菜装至半坛时加入香辛料，装至八成时，加入盐水，要使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。将坛盖边沿的水槽中注满水，以保证坛内的无氧环境。

B、条件：控制腌制的时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐用量过低，腌制时间过短，容易造成细胞大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。

专题二   微生物的培养与应用

课题一 微生物的实验室培养

基础知识

1、培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。

2、培养基种类：（1）培养基按照物理性质可分为液体培养基 半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。菌落是菌种鉴定的依据。液体培养基应用于工业生产，固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。

（2）按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。

（3）按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。

3、培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 （生长因子）等。

碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO₂、NaHCO₃等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。

氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N₂、NH₃、NO₃^-、NH₄⁺（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N₂。

培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件

4、无菌技术·获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：

①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？

答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。

5、消毒与灭菌的区别

   消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。

灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。

6、灭菌方法：

       ①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；

       ②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ；

    ③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。

       ④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。

7、制作牛肉膏蛋白胨固体培养基

（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。

（2）倒平板操作的步骤：

①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。

③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。

④等待平板冷却凝固，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。

·倒平板操作的讨论

（1．）培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？

提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

（2）．为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

（3）．平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过度地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

（4）．在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

8、纯化大肠杆菌

（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。

（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。

（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。

（5）平板划线法操作步骤：

①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。

③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。

⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。

（6）涂布平板操作的步骤：

①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液，滴加到培养基表面。

③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。

④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。

涂布平板操作的讨论

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。

9、菌种的保存

（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

①临时保藏方法

将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。

②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。

10、疑难解答

（1）生物的营养

营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。

人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。

植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳三类。

微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。

（2）确定培养基制作是否合格的方法

将未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。